近日，Nature Communications 发表了中国科学院合成生物学重点实验室杨晟研究组题为 CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum 的研究成果，发现新凶手弗兰西斯菌来源的 Cas 效应蛋白(FnCpf1)与谷氨酸棒杆菌适配，而 SpCas9 则表现出对谷氨酸棒杆菌的毒性，并建立了高效的谷氨酸棒杆菌 CRISPR-Cpf1 基因组编辑系统。
CRISPR-Cpf1-recT系统可在谷氨酸棒杆菌基因组上高效原位饱和突变以筛选高产菌
今天小编特地请来相关科学家与大家聊聊“CRISPR-Cas 引领基因组手术的变革”。
人类的健康问题一直是社会焦点，备受关注。我们或许未曾担忧或同情过视线分辨率之外微生物们的健康。然而，它们也会生病，在复杂的外部环境中，各种外源DNA通过转导、接合转移、转化等方式入侵，例如噬菌体的感染，都会严重影响细菌的正常生长。在与病毒抗争的漫长岁月里，微生物们逐渐进化出了特异的免疫系统来保护自己，CRISPR-Cas系统便是其中的一种免疫方式。
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), 英文直译为“成簇规则的间隔短回文重复序列”，存在于约90%的古菌40%的细菌基因组中。这些微生物们通过发明 CRISPR-Cas 系统来辨别入侵的DNA, 如图1 所示，CRISPR的基因座中通常包含几个非连续的直接重复序列，这些序列被一些可变序列分隔开来。这些可变序列与入侵病毒的DNA相匹配，当有相应外源DNA入侵，便会被微生物识别，此时，CRISPR-Cas 系统中的Cas蛋白便可以对外来DNA进行切割，保护微生物不被侵染。这样的免疫过程包含了对特异DNA序列的识别以及切割过程，当其神秘面纱被揭开的时刻，科学家们发现了这把新型的基因组“手术刀”，便思考着是否能将其应用于基因组的编辑呢？因此CRISPR-Cas系统中的多个Cas蛋白得到了解析，其中核酸酶Cas9与Cpf1这两把潜力非凡的基因组“手术刀”备受关注，被广泛应用于基因编辑工作。
图1 细菌的CRISPR-Cas系统免疫过程
什么是基因编辑？基因编辑也就是在活体细胞的基因组中进行DNA的插入、缺失或者替换。这样的基因组手术是遗传工程的一种形式，可通过对目的基因的改造，进而观测该基因改造对生物产生的表型影响，从而实现对基因功能的研究，被广泛应用于生物研究领域。
进行基因编辑手术的过程需要一把锋利的“手术刀”，对细胞的靶向基因位点进行切割，引入双链断裂，此时细胞自身的修复机制便会被启动，对“伤口”进行修复，从而辅助完成基因编辑过程，根据人工引入的外源修复片段的差异，实现目标基因的插入、缺失或者替换。
从上述基因编辑过程来看，想要进行基因组任意位点的编辑手术，需要一把能够在指定位置切割的“手术刀”，也就是一种可以人工设计识别位点的核酸酶，因此，寻找一把称心如意的“手术刀”，是我们进行“基因手术”所需攻克的难题。
在真核生物中，CRISPR-Cas的“基因手术”出现之前，主要依赖锌指核酸酶 (ZFNs)和TAL (TALENs)效应核酸酶这两把“手术刀”来进行基因编辑。然而，在实际操作过程中，每换一个编辑位点就需要对核酸酶“手术刀”进行重新设计一次，这样重新设计、合成、验证“手术刀”的过程太过繁琐、耗时，使得这两种方法难以快速大规模地使用。
然而CRISPR-Cas系统却有着独特的特点，核酸酶Cas9与Cpf1这两把手术刀对基因的识别过程不依赖于自己的蛋白结构改变，而依赖于一段特异RNA的引导。也就是我们只需要设计需要改造位点的RNA序列，它便可带领着Cas9或者Cpf1去指定的位置切割基因组，引发细胞的基因修复，从而进行DNA插入、缺失或者替换，完成整个基因手术过程。
和传统的两把“手术刀”相比，科学家们在基因手术准备中无需对蛋白进行设计，只要简单设计靶向位点的核酸序列，便可进行基因编辑，与传统方法相比，操作简单，省时快速。
如图2所示，设计与目标基因组切割位点匹配的gRNA后，gRNA便会指引Cas9对基因组进行切割。除了上述在真核生物中的基因编辑外，Cas9与Cpf1也被广泛应用于微生物领域，进行基因组编辑工作，目前使用较多的是来源于酿脓链球菌的Cas9与新凶手弗兰西斯菌的Cpf1。在应用该系统之前，对细菌的基因组进行一次无痕编辑，至少需要一个月，而现在仅需一周的时间便可轻松完成。
图2 基于Cas9基因编辑的核酸设计方法
Cas9与Cpf1这两把新型基因组“手术刀”的发现，如同点燃了一条导火线，迅速引爆整个学术圈，基因组编辑工作不再耗时费力，虽然目前也存在一些缺陷，但CRISPR-Cas系统已为“基因组手术”工作进行了强有力的武装，俗话说“宝刀配英雄”，相信科学家们可利用这套宝刀在科研之路披荆斩棘，创造更多奇迹。
来源：中国科学院上海分院